周景文教授综述：高通量筛选技术在工业生物技

　　工业生物技术利用微生物来生产许多重要的产品，例如生物燃料、酶制剂、抗生素、生物材料和营养化学品等。为了快速高效地筛选出更适于工业化生产的微生物菌株，在自动化设备和快速测定方法不断发展和完善的背景下，各种高通量筛选（high-throughput screening，HTS）策略应运而生。

　　在最新发表于Cell Press细胞出版社旗下Trends in Biotechnology期刊的综述“High-Throughput Screening Technology in Industrial Biotechnology”中，来自江南大学陈坚院士团队的周景文教授课题组深入探讨了提高HTS效率的重要因素，并总结了HTS在强化工业微生物性能方面的应用，以及在合成生物学、纳米技术和人工智能快速发展的背景下，工业生物技术中的HTS当前所面临的挑战和潜在的改进措施。

　　天然存在的微生物经常存在产量低、对工业条件耐受性差等不足，因此很少被直接用于工业生产。研究人员目前已经开发出各种策略来克服这些问题，包括通过在基因水平上改变微生物的生理功能、为菌株生长和产物积累提供最佳环境等。这些经过改造后被用于工业生产的微生物，通常被称为细胞工厂。

　　研究人员通常采用随机或定向诱变的方法来提高细胞工厂中目标产物的积累。由于有益突变的概率可能非常低，开发在大型突变体库中快速筛选目标微生物菌株的方法就变得尤为重要。常规的筛选效率由于通量低、检测慢、劳动强度高，导致筛选成本昂贵、效率低下。针对上述问题，高通量筛选（HTS）结合了自动化和微定量实验以及大规模数据分析等先进手段，已被广泛用于工业生物技术的基础和应用研究。

　　诱变技术已广泛应用于培育工业微生物，目前仍被认为是产生优良工业微生物的有效途径。常用的物理和化学诱变方法包括紫外线、α射线、β射线、γ射线、X射线、使用烷化剂和碱类似物等。另外，一些新的诱变方法，如室温常压等离子体（ARTP）和重离子等技术也得到广泛应用，与传统方法相比，这两种方法具有突变率高、随机突变位点多和不需要有毒有害化学品等优势。

　　ALE是基于微生物通过有益突变适应环境条件的能力，常与代谢工程和合成生物学策略相结合，以构建更高效的微生物细胞工厂。其典型的应用包括（i）强化微生物对恶劣环境的适应性；（ii）提高菌株的生长速度、底物消耗或产物积累能力;（iii）激活合成非天然产物或消耗非天然底物的潜在途径。eVOLVER、微滴微生物培养（MMC）系统等已被设计用于微生物高通量培养和适应性进化。另外，基于ALE的原理，基因组复制工程辅助的连续进化（GREACE）系统也被开发用于强化菌株的性能（图2B）。

　　定向进化是改造酶的有效方法，已被广泛用于工业生物合成过程。根据构建突变库的方法，定向进化可分为非理性设计、理性设计以及半理性设计。非理性设计是一种不需要深入了解酶的序列和结构随机进化策略，主要包括易错PCR、DNA改组和饱和突变等（图2C）。理性设计是一种基于智能计算策略的改造方法，用于模拟天然酶的动力学和进化，通过这种方法可以更有效地筛选目标突变体。半理性设计是将非理性设计与理性设计相结合而形成的，是目前应用最为广泛的一条路径。

　　为了以更合理的方式构建菌株库,研究人员已经建立了许多基于随机组装的策略，如启动子-5-UTR复合物与基因的随机组装、多重自动化基因组工程（MAGE）、ePathBrick、CasEMBLR以及COMPASS等（图2D）。这些随机组装策略有助于构建具有多种不同功能和调节单元的大型文库。

　　高通量筛选的实现通常基于精准的高通量检测设备。酶标仪是HTS中最常用的设备，多功能酶标仪也已被广泛应用于细胞生长或凋亡、代谢物含量、酶活性等的检测。此外，研究人员还开发了基于拉曼光谱等特殊光谱等来检测更多化学物质的设备，其中一些设备可以与流式荧光激活细胞分选（FACS）、微流控和光镊技术等协同应用，进一步发展并用于高通量单细胞检测、分析和分类。

　　自动化是HTS的一项重要特征，是进行微定量实验和大规模分析的基础。HTS集成了一系列连续的自动化实验操作，经典的HTS设备主要包括自动挑菌仪、移液工作站，以及多功能酶标仪等。此外，PCR仪、离心机、灭菌系统和包装系统等一系列附属设备也经过相应的改进，被集成到HTS系统中用于进一步提高筛选效率。

　　流式细胞术可以快速分析单个细胞的多个参数，如细胞密度和大小、内部复杂度以及其他荧光信号，并以多种方式对目标群体进行快速分类，从而以高纯度和高通量筛选目标细胞。基于流式细胞术的FACS技术已成为基础生物学研究和工业应用中必不可少的工具。

　　微流控技术是一种用于处理微升至皮升级液体的技术，其核心为被称为“芯片实验室”的微流控芯片。基于微流控技术，研究人员开发出了用于单细胞分析的微流控系统，其具有高灵敏度、定量读出和准确性等优点。

　　FACS一般被应用于分析细胞内荧光信号的或膜结合产物，而工业生物技术中的大多数目标产物是胞外产物，使得FACS应用受到限制；而微流控技术的缺点是其筛选速度远低于FACS。因此，结合了微流控和细胞分选的微流控流式分选技术(FADS)，打破了传统FACS和微流控技术的局限性，以其有效的识别和分离方法而备受关注。

　　目前已经建立了许多基于紫外光/可见光谱、特殊光谱、荧光信号等的筛选方法。紫外光/可见光谱及荧光信号检测法可以分为直接法和间接法（图4A、4B）。对于具有特殊分子结构或颜色特性的产物，可通过直接测量吸光度进行筛选，而对于没有直接吸光特性的产物可以通过加入pH指示剂、与金属离子螯合、或与酶促或化学反应偶联间接来检测。使用荧光染料或探针生成的荧光信号也已被广泛应用于筛选工业微生物，基于荧光的HTS还可以实现超高通量筛选（uHTS）。

　　基于拉曼光谱，傅里叶变换红外（FTIR）和傅里叶变换近红外（FTNIR）光谱等特殊光谱的策略也已在工业生物技术中得到应用（图4E）。这些方法具有快速、灵敏、无损、高通量和实时检测等优势，并已经被用于单细胞和生物催化剂的无标记筛选。

　　某些目标产物或关键中间产物不能被直接或间接的颜色或荧光反应进行检测，从而限制了高通量筛选技术的使用，而基于各类传感器的筛选方法可以作为一种替代策略。目前，应用较多的主要有生物传感器（Biosensor）和电化学传感器（Electrochemical Sensor，ES）。生物传感器由传感元件和报告元件组成。传感元件识别特定的细胞内代谢物，通过一系列基因回路后由报告元件生成定量信号，目前已开发出了基于蛋白质和基于核酸的生物传感器（图4C）。电化学传感器则是利用电极表面发生生化反应而产生的电流变化进行检测，具有对目标高度敏感、选择性强、响应快速等优势，已广泛应用于临床诊断、食品中有害成分分析和环境监测，但目前涉及ES在工业生物技术中检测特定发酵产物的应用研究仍较少。

　　周景文，江南大学教授，教育部青年长江学者，国家自然科学基金优秀青年科学基金获得者。2003年华中农业大学本科毕业，2006年华中农业大学硕士毕业，2009年在江南大学获得工学博士学位。2009年加入江南大学生物工程学院。2012-2013年在哈佛大学化学与化学生物学系进行博士后研究。研究兴趣包括合成生物学在植物天然产物合成和新资源食品中的应用。近5年在Metab. Eng.、Green Chem.、Microbiol. Mol. Biol. Rev.、Trends Biotechnol.等发表论文30篇。曾先后获得国家技术发明奖二等奖、中国专利金奖等科研奖励。目前担任江南大学未来食品科学中心副主任，中国生物工程学会青年工作委员会副主任，《生物工程学报》、Frontiers in Bioengineering and Biotechnology和Electronic Journal of Biotechnology编委。

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